光學顯微鏡

                            optical microscope

                            利用光學原理把人眼所不能分辨的微小物體放大成像,以供人們提取微細結構信息的光學儀器。

                            簡史 早在公元前 1世紀,人們就已發現通過球形透明物體去觀察微小物體時可以使其放大成像。后來逐漸對球形玻璃表面能使物體放大成像的規律有了認識。1590年,荷蘭和意大利的眼鏡制造者已經造出類似顯微鏡的放大儀器。1610年前后,意大利的伽利略和德國的J.開普勒在研究望遠鏡的同時,改變物鏡和目鏡之間的距離,得出合理的顯微鏡光路結構,當時的光學工匠遂紛紛從事顯微鏡的制造、推廣和改進。17世紀中葉,英國的R.胡克和荷蘭的 A.van列文胡克都對顯微鏡的發展作出了卓越的貢獻。1665年前后,胡克在顯微鏡中加入粗動和微動調焦機構、照明系統和承載標本片的工作臺。這些部件經過不斷改進,成為現代顯微鏡的基本組成部分。1673~1677年期間,列文胡克制成單組元放大鏡式的高倍顯微鏡,其中9臺保存至今。胡克和列文胡克利用自制的顯微鏡在動、植物機體微觀結構的研究方面取得了杰出的成就。19世紀,高質量消色差浸液物鏡的出現使顯微鏡觀察微細結構的能力大為提高。1827年G.B.阿米奇第一個采用浸液物鏡。19世紀70年代,德國人E.阿貝奠定了顯微鏡成像的古典理論基礎。這些都促進了顯微鏡制造和顯微觀察技術的迅速發展,并為19世紀后半葉包括R.科赫、L.巴斯德等在內的生物學家和醫學家發現細菌和微生物提供了有力的工具。

                            在顯微鏡本身結構發展的同時,顯微觀察技術也在不斷創新:1850年出現了偏光顯微術,1893年出現了干涉顯微術,1935年荷蘭物理學家F.澤爾尼克創造了相襯顯微術,他為此在1953年被授予諾貝爾物理學獎金。

                            古典的光學顯微鏡只是光學元件和精密機械元件的組合,它以人眼作為接收器來觀察放大的像。后來在顯微鏡中加入了攝影裝置,以感光膠片作為可以記錄和存儲的接收器。現代又普遍采用光電元件、電視攝象管和電荷耦合器等作為顯微鏡的接收器,配以微型電子計算機后構成完整的圖象信息采集和處理系統。

                            工作原理 表面為曲面的玻璃或其他透明材料制成的光學透鏡可以使物體放大成像。光學顯微鏡就是利用這一原理把微小物體放大到人眼足以觀察的尺寸。近代的光學顯微鏡通常采用兩級放大,分別由物鏡和目鏡完成。被觀察物體AB位于物鏡的前方,被物鏡作第一級放大后成一倒立的實象A1B1。然后此實像再被目鏡作第二級放大,成一虛象A2B2,人眼看到的就是虛像A2B2。

                            顯微鏡的總放大倍率為
                            顯微鏡總放大倍率=物鏡放大倍率×目鏡放大倍率

                            放大倍率是指直線尺寸的放大比而不是面積比。在用人眼直接觀察的顯微鏡中,可以在實像面A1B1處放置一塊薄型平板玻璃片,其上刻有某種圖案的線條,例如十字線。當實像A1B1和這些刻線疊合在一起時,利用這些刻線就能對物體進行瞄準定位或尺寸測量。這種放置在實像面處的薄型平板玻璃片通稱分劃板。在新型的以光電元件作為接收器的光學顯微鏡中,電視攝象管的靶面或其他光電元件的接收面就設置在實像面上。

                            組成 光學顯微鏡由載物臺、聚光照明系統、物鏡、目鏡和調焦機構組成。

                            載物臺 用于承放被觀察的物體。利用調焦旋鈕可以驅動調焦機構使載物臺作粗調和微調的升降運動,使被觀察物體調焦清晰成象。它的上層可以在水平面內沿、方向作精密移動和在水平面內轉動,把被觀察的部位調放到視場中心。

                            聚光照明系統 由燈源和聚光鏡構成。當被觀察物體本身不發光時,由外界光源給以照明。照明燈的光譜特性必須與顯微鏡的接收器的工作波段相適應。聚光鏡的功能是使更多的光能集中到被觀察的部位。

                            物鏡 位于被觀察物體附近實現第一級放大的鏡頭。在物鏡轉換器上同時裝著幾個不同放大倍率的物鏡。轉動轉換器可讓不同倍率的物鏡進入工作光路。物鏡放大倍率通常為5~100倍。物方視場直徑(即通過顯微鏡能看到的圖像范圍)約為 11-20毫米。物鏡放大倍率越高則視場越小。 物鏡是顯微鏡中對成象質量優劣起決定性作用的光學元件。常用的有:①能對兩種顏色的光線校正色差的消色差物鏡;②質量更高的能對三種色光校正色差的復消色差物鏡;③能保證物鏡的整個像面為平面以提高視場邊緣成像質量的平像場物鏡。為了提高顯微觀察的分辨率,在高倍物鏡中采用浸液物鏡,即在物鏡的下表面和標本片的上表面之間填充折射率為1.5左右的液體。

                            目鏡 位于人眼附近實現第二級放大的鏡頭。目鏡放大倍率通常為5~20倍,按能否放置分劃板,可分成兩類:①不宜放置分劃板的,如惠更斯型目鏡。這是現代顯微鏡中常用的型式,優點是結構簡單、價格低廉;缺點是由于成像質量的原因,不宜放置供瞄準定位或尺寸測量用的分劃板。②能放置分劃板的,如凱爾納型和對稱型目鏡,它們能克服上述目鏡的缺點。按照能看到的視場大小,目鏡又分為視場較小的普通目鏡和視場較大的大視場目鏡(或稱廣角目鏡)兩類。

                            調焦機構 載物臺和物鏡兩者必須能沿物鏡光軸方向作相對運動以實現調焦,獲得清晰的圖像。用高倍物鏡工作時,容許的調焦范圍往往小于微米,所以顯微鏡必須具備極為精密的微動調焦機構。

                            顯微鏡放大倍率的極限 顯微鏡放大倍率的極限即有效放大倍率。儀器的分辨率是指儀器提供被測對像微細結構信息的能力。分辨率越高則提供的信息越細致。顯微鏡的分辨率是指能被顯微鏡清晰區分的兩個物點的最小間距。根據衍射理論,顯微物鏡的分辨率為
                            sigma=0.61lamda/N.sinU ~1式中lamda為所用光波的波長;N 為物體所在空間的折射率,物體在空氣中時N=1;U為孔徑角,即從物點發出能進入物鏡成像的光線錐的錐頂角的半角;NsinU 稱為數值孔徑。 當波長λ一定時, 分辨率取決于數值孔徑的大小。數值孔徑越大則能分辨的結構越細,即分辨率越高。數值孔徑是顯微物鏡的一個重要性能指標,通常與放大倍率一起標注在物鏡鏡筒外殼上,例如40×0.65表示物鏡的放大倍率為40倍,數值孔徑為0.65。
                            分辨率和放大倍率是兩個不同的但又互有聯系的概念。當選用的物鏡數值孔徑不夠大,即分辨率不夠高時,顯微鏡不能分清物體的微細結構,此時即使過度地增大放大倍率,得到的也只能是一個輪廓雖大但細節不清的圖像。這種過度的放大倍率稱為無效放大倍率。反之如果分辨率已滿足要求而放大倍率不足,則顯微鏡雖已具備分辨的潛在能力,但因圖像太小而仍然不能被人眼清晰視見。為了充分發揮顯微鏡的分辨能力,應使數值孔徑與顯微鏡總放大倍率合理匹配,以滿足下列條件:
                            500NsinU<顯微鏡總放大倍率<1000NsinU ~2
                            在此范圍內的放大倍率稱為有效放大倍率。由于sinU永遠小于1,物方空間折射率N最高約為1.5,NsinU不可能大于1.5,故光學顯微鏡的分辨率受(1)式限制,具有一定的極限。有效放大倍率受上式限制,一般不超過1500倍。顯微鏡使用者應由所需分辨的最小尺寸按(1)式確定所需的數值孔徑,選定物鏡,然后按(2)式選定總放大倍率和目鏡放大倍率。
                            提高分辨率的途徑是:采用較短波長的光波或增大孔徑角U值,或是提高物體所在空間的折射率N,例如在物體所在空間填充折射率為 1.5的液體。以這種方式工作的物鏡稱為浸液物鏡。而電子顯微鏡正是利用波長極短的特性,在提高分辨率方面取得重大突破的。

                            聚光照明系統對顯微觀察的影響 聚光照明系統是對顯微鏡成像性能有較大影響但又易于被使用者忽視的環節。它的功能是提供亮度足夠且均勻的物面照明。聚光鏡發來的光束應能保證充滿物鏡孔徑角,否則就不能充分利用物鏡所能達到的最高分辨率。為此目的,在聚光鏡中設有類似照相物鏡中的可以調節開孔大小的可變孔徑光闌,用來調節照明光束孔徑,以與物鏡孔徑角匹配。觀察高反差物體時,宜使照明光束充滿物鏡的全孔徑;對于低反差物體,宜使照明光束充滿物鏡的2/3孔徑。在較完善的柯勒照明系統中,除可變孔徑光闌外,還裝有控制被照明視場大小的可變視場光闌,以保證被照明的物面范圍與物鏡所需的視場匹配。物面被照明的范圍太小固然不行,過大則不僅多余,甚至有害,因為有效視場以外的多余的光線會在光學零件表面和鏡筒內壁多次反射,最后作為雜散光到達像面,使圖像的反差下降。

                            上海思長約光學儀器有限公司 

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